Assassin's Creed é um videogame de ação e aventura não linear, durante o qual o jogador controla um Assassino Levantino do século XII chamado Altaïr Ibn-La'Ahad durante a Terceira Cruzada, cuja vida é vivida através do Animus por seu descendente do século XXI, Desmond Miles.

Desmond Miles, um barman, é sequestrado pela empresa Abstergo Industries para ser usado como cobaia no "Animus", um dispositivo que pode simular a memória genética. A Abstergo pretende colocar Desmond no dispositivo para recordar as memórias de seu antepassado, Altaïr Ibn-La'Ahad, membro da Irmandade dos Assassinos no ano de 1191, que viveu durante a Terceira Cruzada na Terra Santa. Inicialmente, Desmond tem problemas para se ajustar ao dispositivo, mas eventualmente revive as façanhas de Altaïr nos próximos dias. O jogo então muda principalmente para o ponto de vista de Altaïr, com transições ocasionais para Desmond, devido a problemas com o Animus ou início do Efeito Sangramento. O jogo começa com Desmond entrando na memória de Altaïr, mas ele logo enfrenta problemas de sincronização. Nisso, as vozes de Lucy Stillman e Warren Vidic podem ser ouvidas, discutindo sobre a segurança de Desmond dentro do Animus. Depois de enfrentar alguns problemas, Desmond sai da máquina virtual e Vidic o informa sobre o funcionamento interno do Animus, antes de inicializar o programa tutorial da máquina. Depois que Desmond termina o tutorial, ele entra na memória sincronizável mais próxima de Altaïr; Lucy acrescenta que Desmond tem que reviver momentos-chave da vida de Altaïr para aumentar sua sincronização, antes de chegar à memória final que contém as informações que a Abstergo está procurando. Altaïr é mostrado pela primeira vez tentando recuperar um de uma série de artefatos conhecidos como "Pedaços do Éden" do Templo de Salomão com a ajuda de Malik Al-Sayf e seu irmão Kadar, mas eles são parados por Robert de Sablé, Grão-Mestre dos Cavaleiros Templários e inimigo jurado dos Assassinos. Ao recuperar o tesouro, Altaïr quebra todos os três princípios do Credo dos Assassinos na tentativa de matar Robert, mas ele finalmente falha. Na comoção seguinte, o irmão de Malik é morto e o braço esquerdo de Malik é aleijado e depois amputado. Quando Altaïr retorna à fortaleza dos Assassinos em Masyaf com desculpas, Malik, que sobreviveu a de Sablé, volta com o artefato e deprecia Altaïr por causa de sua arrogância. Depois de derrotar por pouco um ataque de retaliação dos Templários, Al Mualim, líder dos Assassinos, rebaixa Altaïr a um novato, mas lhe dá outra chance de subir nas fileiras da Irmandade. Al Mualim atribui a Altaïr a tarefa de assassinar nove figuras-chave em toda a Terra Santa em Jerusalém, Acre e Damasco, com o objetivo de trazer a paz entre as forças cruzadas e sarracenas. Cada alvo é baseado em uma figura histórica real da Terceira Cruzada, incluindo Majd Addin, Garnier de Naplouse, Jubair al Hakim, Abu'l Nuqoud, Sibrand, William de Montferrat e Robert de Sablé. Altaïr conclui cada tarefa, aprendendo como cada alvo está conectado a Robert e aos Templários e como juntos eles visam acabar com as Cruzadas e colocar a Terra Santa sob seu próprio controle. Com homens de ambos os lados mortos, ele descobre que a última trama de Robert é tentar unir as forças cristãs e muçulmanas contra seu novo inimigo comum, os próprios Assassinos. Altaïr derrota de Sablé diante de Ricardo Coração de Leão, não conseguindo convencer o rei de que o fim da guerra seria bem-vindo para ambos os lados, mas acabando com a trama de Robert. De Sablé, Altaïr descobre que Al Mualim era ele mesmo um membro dos Templários e usou o Assassino para matar os outros membros que mantinham o segredo do poder do tesouro, para que ele pudesse egoisticamente manter o artefato para si mesmo. Altaïr rapidamente retorna a Masyaf e se aproxima de seu mestre, que lhe revela a verdade: o Pedaço do Éden, que ele havia recuperado com a ajuda de Altaïr diretamente antes de sua transgressão, cria ilusões. Ele denuncia a religião e outros eventos aparentemente sobrenaturais (por exemplo, as Dez Pragas do Egito, a divisão do Mar Vermelho e a presença dos Deuses Gregos na Guerra de Tróia) como ilusões causadas pela Peça, e então declara sua intenção de usar o artefato para obrigar a humanidade a um estado de lavagem cerebral e, ao fazê-lo, pôr fim a todos os conflitos; Altaïr é eventualmente capaz de ver através dos enganos criados pelo artefato para matar Al Mualim. Quando Altaïr recupera o artefato, o Pedaço do Éden é ativado, mostrando uma visão holográfica do mundo com vários locais de outros Pedaços do Éden marcados em todo o mundo. Quando o processo é concluído, Desmond descobre que a Abstergo é uma frente moderna dos Templários, e eles já estão procurando outros artefatos em locais identificados nas memórias de Altaïr. Além disso, ele descobre que os Assassinos modernos tentaram resgatá-lo antes que a memória se completasse, mas falharam. Depois disso, Desmond deveria ser morto após uma ordem de um templário de alto escalão, Alan Rikkin, mas Lucy Stillman o salva da morte e, a certa altura, enfia o dedo anelar na palma da mão, referindo-se à tradição dos Assassinos de cortar o dedo. Embora Desmond permaneça preso no laboratório da Abstergo, sua experiência no Animus criou um Efeito Sangrento da vida de Altaïr, permitindo que Desmond use a Visão de Águia de Altaïr, que, por sua vez, permite que ele veja mensagens estranhas pintadas nas paredes de seu quarto e no chão do LAB. Todas as mensagens tratam de várias formas do fim do mundo de diferentes culturas, incluindo várias referências a 21 de dezembro de 2012, data em que a Abstergo planeja lançar um satélite que "encerrará permanentemente a guerra". - Insinua-se que esse método seria pelo mesmo método que Al Mualim hipnotizou Masyaf, só que em maior escala. Finalmente, o jogo termina com Desmond se perguntando o que todas as imagens significam e quem poderia tê-las desenhado.